Santa Ana de Pusa es el último pueblo fundado en el Sefiorio de Valdepusa , siendo sus primeros fundadores Diego Garcia de Lopez y Blas Munoz en el 1522. Fallecidos estos, el señor de Valdepusa, en 1524, funda un caserío y para poder repoblarlo, concede carta puebla el 16 de Octubre de 1526 a veintidós vecinos de Magán, que denominaron el lugar como "Santa Ana de Bienvenida".
Las Relaciones Topográficas de Felipe II de 1578 aportan relevantes datos sobre la población:
"En las primeros momentos parece que fueron dos pequeños núcleos El Canchar o Canchal y otro en torno a la ermita de Nuestra Señora de Bienvenida. El nombre de este lugar se debe a que está dedicada su iglesia a Santa Ana y porque antes hubo una ermita a media legua del pueblo dedicada a Nuestra Señora de Bienvenida. Es aldea de San Martín de Valdepusa. La administración está en manos de un alcalde ordinario, de un regidor y de un mayordomo, con una jurisdicción en las pleitos de 100 mrs, cuando exceden de esa cantidad van a San Martín. Es tierra montosa, áspera, con riscales. "Es harto de leña" de la Dehesa de Valdepusa, en donde hay gamos. Discurre par su termino el arroyo Pusa. Carecen sus riberas de huertas y casi de peces. La aldea es falta de agua. Van a moler al Rio Tajo. Su termino es es trecho, carece de pastas. A media legua al oeste esta la tierra de Talavera, villa de la que traen las más de las cosas y de Santa Olalla; la sal procede de Las Espartinas (es sal gema). Como son pobres no pueden traer tejas para sus viviendas. La iglesia es pequeña , se ha construido de limosnas de los vecinos".
